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應用易錯APCR定向進化聚合甘油脫氫酶
經(jīng)過連續(xù)易錯聚合酶鏈式反應(Error-Prone PCR)向克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)聚合甘油脫氫酶基因中引進驟變,并構建驟變文庫。依據(jù)驟變體催化番紅O顯色的特性,選用瓊脂平板法和96微孔板法相結合的高通量挑選方法,成功獲得驟變體gldA-74,其酶生機是親本重組酶的2.73倍。經(jīng)過軟件對驟變體gldA-74酶基因和親本重組酶基因進行剖析比照,發(fā)現(xiàn)驟變體gldA-74酶基因發(fā)生了一處點驟變(A964T),該驟變使一處氨基酸被替代。將親本重組酶和進化酶的高效表達產(chǎn)物經(jīng)Ni柱純化后,酶學性質的測定結果表明,聚合甘油的Km值由0.58 mmol?L^(-1)升高至0.63 mmol?L^(-1),而NAD的Km值由0.74 mmol?L^(-1)升高至0.77mmol?L^(-1),并且酶的最適pH值由本來的11.5升高至12.5,而最適溫度由65℃降至55℃。